4.3: Replicazione del DNA (2023)

Istruzioni di copiatura

L'unico modo per creare nuove cellule è la divisione di cellule preesistenti. Gli organismi unicellulari subiscono la divisione per produrre più cellule simili a loro, mentre gli organismi multicellulari nascono attraverso la divisione di una singola cellula, generalmente l'uovo fecondato. Ogni volta che una cellula si divide, tutto il suo DNA deve essere copiato fedelmente in modo che una copia di questa informazione possa essere trasmessa alla cellula figlia. Questo processo è chiamato replicazione del DNA. È il mezzo attraverso il quale l'informazione genetica può essere trasmessa attraverso generazioni di cellule e assicura che ogni nuova cellula abbia una copia completa del genoma. Nella prossima sezione esamineremo il processo mediante il quale il DNA di una cellula viene completamente e accuratamente copiato.

La struttura del DNA chiarita da Watson e Crick nel 1953 suggerì immediatamente un meccanismo mediante il quale il DNA a doppio filamento poteva essere copiato per dare due copie identiche del DNA. Proposero che i due filamenti della molecola di DNA, che sono tenuti insieme da legami idrogeno tra i nucleotidi accoppiati di basi, si separassero e ciascuno servisse da modello su cui assemblare un filamento complementare (Figura 7.8). Le regole di accoppiamento delle basi garantirebbero che questo processo porti alla produzione di due molecole di DNA identiche. La bella semplicità di questo schema si dimostrò corretta in successivi esperimenti di Meselson e Stahl, che dimostrarono che la replicazione del DNA era semi-conservativa, cioè che dopo la replicazione, ciascuna delle due molecole di DNA risultanti era costituita da un vecchio filamento e un nuovo filamento che era stato assemblato di fronte (Figura 7.9).

Materiali da costruzione

Quali sono gli ingredienti necessari per costruire una nuova molecola di DNA? Come notato sopra, la molecola di DNA originale o parentale funge da modello. Nuove molecole di DNA vengono assemblate di fronte a ciascun modello unendo insieme nucleotidi di DNA liberi come indicato dalle regole di accoppiamento delle basi, con As di fronte a Ts e G di fronte a Cs.

I nucleotidi utilizzati nella sintesi del DNA sono i desossiribonucleosidi trifosfati o dNTP. Come si può dedurre dal loro nome, tali nucleotidi hanno uno zucchero desossiribosio e tre fosfati, oltre a una delle quattro basi del DNA, A, T, C o G (Figura 7.10).

Quando i dNTP vengono aggiunti in un filamento di DNA in crescita, due di quei fosfati verranno scissi, come descritto in seguito, lasciando i nucleotidi in una molecola di DNA con un solo fosfato per nucleotide. Questa reazione è catalizzata da enzimi noti come DNA polimerasi, che creano legami fosfodiestere tra un nucleotide e il successivo.

Sfide

Prima di esaminare l'effettivo processo di replicazione del DNA, è utile pensare a cosa serve per portare a termine con successo questo compito. Considera le sfide che una cellula deve affrontare in questo processo:

• Il semplice numero di nucleotidi da copiare è enorme: ad esempio, nelle cellule umane, dell'ordine di diversi miliardi.
• Una molecola di DNA parentale a doppia elica deve essere srotolata per esporre singoli filamenti di DNA che possono servire come modelli per la sintesi di nuovi filamenti di DNA.
• Lo svolgimento deve essere realizzato senza introdurre una distorsione topologica nella molecola.​
• I singoli filamenti di DNA svolti devono essere tenuti lontani dal riunirsi abbastanza a lungo da consentire la sintesi dei nuovi filamenti.
• Le DNA polimerasi non possono iniziare la sintesi di un nuovo filamento di DNA de novo e richiedono un 3' OH libero a cui possono aggiungere deossinucleotidi.
• Le DNA polimerasi possono solo estendere un filamento nella direzione da 5' a 3'. La crescita da 5' a 3' di entrambi i nuovi filamenti significa che uno dei filamenti è fatto a pezzi.
• L'uso di primer di RNA richiede che i nucleotidi di RNA debbano essere rimossi e sostituiti con nucleotidi di DNA e che i frammenti di DNA risultanti debbano essere uniti.
• La copiatura di tutto il DNA parentale deve essere accurata, in modo che non vengano introdotte mutazioni nel DNA appena formato.

Figura 7.14 - Replicazione del DNA procariotico vs. eucariotico - Wikipedia

Affrontare le sfide

Con questo in mente, possiamo iniziare a esaminare come le cellule affrontano ciascuna di queste sfide. La nostra comprensione del processo di replicazione del DNA deriva da studi che utilizzano batteri, lieviti e altri sistemi. Queste indagini hanno rivelato che la replicazione del DNA è effettuata dall'azione di un gran numero di proteine ​​che agiscono insieme come una complessa macchina proteica. Sono state identificate e caratterizzate numerose proteine ​​coinvolte nella replicazione, comprese diverse DNA polimerasi sia nei procarioti che negli eucarioti. Sebbene le proteine ​​specifiche coinvolte siano diverse nei batteri e negli eucarioti, è utile comprendere le considerazioni di base che sono rilevanti in tutte le cellule. Di seguito viene presentato un resoconto generalizzato delle fasi della replicazione del DNA, incentrato sulle sfide sopra menzionate.

• Il semplice numero di nucleotidi da copiare è enorme: ad esempio, nelle cellule umane, dell'ordine di diversi miliardi.

Le cellule, siano esse batteriche o eucariotiche, devono replicare tutto il loro DNA prima di potersi dividere. Nelle cellule come la nostra, la grande quantità di DNA è scomposta in molti cromosomi, ognuno dei quali è composto da un filamento lineare di DNA (Figura 7.12). In cellule come quelle di E. coli, c'è un singolo cromosoma circolare.

In entrambe le situazioni, la replicazione del DNA viene avviata in siti chiamati origini di replicazione. Queste sono regioni della molecola del DNA che sono riconosciute da speciali proteine ​​chiamate proteine ​​iniziatori che legano il DNA. In E.coli, le origini hanno piccole regioni di sequenze ricche di A-T che vengono "fuse" per separare i filamenti, quando le proteine ​​​​iniziatrici si legano all'origine o alla replicazione. Come forse ricorderete, le coppie di basi A-T, che hanno due legami idrogeno tra di loro, si rompono più facilmente rispetto alle coppie di basi G-C che ne hanno tre ciascuna (Figura 7.15).

Quante origini di replicazione ci sono su un cromosoma? Nel caso di E. coli, esiste un'unica origine di replicazione sul suo cromosoma circolare. Nelle cellule eucariotiche ci possono essere molte migliaia di origini di replicazione, con ogni cromosoma che ne ha centinaia (Figura 7.16). La replicazione del DNA viene quindi avviata in più punti lungo ciascun cromosoma negli eucarioti. Le micrografie elettroniche della replicazione del DNA da cellule eucariotiche mostrano molte bolle di replicazione su un singolo cromosoma. Ciò ha senso alla luce della grande quantità di DNA che deve essere copiata in cellule come la nostra, dove iniziare da un'estremità di ciascun cromosoma e replicarsi fino all'altra estremità da un'unica origine richiederebbe semplicemente troppo tempo. . Questo nonostante il fatto che le DNA polimerasi nelle cellule umane siano in grado di costruire nuovi filamenti di DNA alla rispettabilissima velocità di circa 50 nucleotidi al secondo!

• Una molecola parentale a doppia elica deve essere srotolata per esporre singoli filamenti di DNA che possono servire da modelli per la sintesi di nuovi filamenti di DNA.

Svolgimento

Una volta che una piccola regione del DNA è stata aperta a ciascuna origine di replicazione, l'elica del DNA deve essere srotolata per consentire la replicazione. Lo svolgimento dell'elica del DNA richiede l'azione di un enzima chiamato elicasi.

Helicaseutilizza l'energia rilasciata quando l'ATP viene idrolizzato, per rompere i legami idrogeno tra le basi nel DNA e separare i due filamenti (Figura 7.17). Si noti che una bolla di replicazione è costituita da due forcelle di replicazione che "si muovono" o si aprono, in direzioni opposte. Ad ogni fork di replicazione, i filamenti di DNA parentale devono essere srotolati per esporre nuove sezioni di stampo a singolo filamento.

• Questo svolgimento deve essere realizzato senza introdurre una distorsione topologica nella molecola.

Qual è l'effetto dello svolgimento di una regione della doppia elica? Lo svolgimento locale della doppia elica provoca un sovraavvolgimento (aumento del superavvolgimento positivo) prima della regione svolta.

Il DNA davanti alla forcella di replicazione deve ruotare, altrimenti si attorciglierà su se stesso e bloccherà la replicazione. Questo è un grosso problema, non solo per i cromosomi batterici circolari, ma anche per i cromosomi eucariotici lineari, che, in linea di principio, potrebbero ruotare per alleviare lo stress causato dall'aumento del superavvolgimento.

Topoisomerasi

Il motivo per cui questo è problematico è che non è possibile ruotare l'intera lunghezza di un cromosoma, con i suoi milioni di paia di basi, poiché il DNA alla forcella di replicazione è svolto. Come si risolve allora questo problema? Gli enzimi chiamati topoisomerasi possono alleviare lo stress topologico causato dallo "srotolamento" locale dei venti extra della doppia elica. Lo fanno tagliando uno o entrambi i filamenti del DNA e permettendo ai filamenti di ruotare l'uno intorno all'altro per rilasciare la tensione prima di ricongiungersi alle estremità. In E. coli, la topoisomerasi che svolge questa funzione è chiamata girasi.

• I singoli filamenti di DNA separati devono essere tenuti lontani dal riunirsi in modo che i nuovi filamenti vengano sintetizzati.

Proteina legante il DNA a singolo filamento

Una volta che i due filamenti della molecola del DNA parentale sono separati, deve essere impedito loro di tornare insieme per formare DNA a doppio filamento. Per garantire che le regioni non avvolte del DNA parentale rimangano a filamento singolo e disponibili per la copia, i filamenti separati del DNA parentale sono legati da molte molecole di una proteina chiamata proteina legante il DNA a filamento singolo (SSB - Figura 7.18).

Figura 7.18 - Proteine ​​a un fork di replicazione del DNA procariotico - Immagine di Martha Baker

• Le DNA polimerasi non possono iniziare la sintesi di un nuovo filamento di DNA de novo e richiedono un 3' OH libero a cui possono aggiungere nucleotidi di DNA.

Sebbene il DNA parentale a filamento singolo sia ora disponibile per la copia, le DNA polimerasi non possono iniziare la sintesi di un filamento complementare de novo. Ciò significa semplicemente che le DNA polimerasi possono solo aggiungere nuovi nucleotidi all'estremità 3' di una catena preesistente e non possono avviare una catena di nucleotidi da sole. A causa di questa limitazione, qualche enzima diverso da una DNA polimerasi deve prima creare una piccola regione di acido nucleico, complementare al filamento parentale, che può fornire un 3' OH libero a cui la DNA polimerasi può aggiungere un desossiribonucleotide. Questo compito è svolto da un enzima chiamato aprimase, che assembla un breve tratto di base di RNA accoppiato al modello di DNA parentale. Ciò fornisce una breve regione accoppiata di basi, chiamata primer dell'RNA, con un gruppo 3'OH libero a cui la DNA polimerasi può aggiungere il primo nuovo nucleotide di DNA (Figura 7.12).

Morsetto scorrevole

Una volta che un primer fornisce un 3'OH libero per l'estensione, altre proteine ​​entrano in azione. Queste proteine ​​sono coinvolte nel caricamento della DNA polimerasi sullo stampo innescato e nel mantenerlo associato al DNA. Il primo di questi è il caricatore di pinze. Come suggerisce il nome, il clamp loader aiuta a caricare un complesso proteico chiamato clamp scorrevole sul DNA in corrispondenza della forcella di replicazione (Figure 7.19 e 7.20). Il morsetto scorrevole, una proteina a forma di anello multi-subunità, viene quindi unito dalla DNA polimerasi. La funzione del morsetto scorrevole è di mantenere la polimerasi associata alla forcella di replicazione - infatti, è stata descritta come una cintura di sicurezza per la DNA polimerasi. Il morsetto scorrevole assicura che la DNA polimerasi sia in grado di sintetizzare lunghi tratti di nuovo DNA prima che si dissocia dallo stampo. La proprietà di rimanere associato allo stampo per lungo tempo prima di dissociarsi è nota come processività dell'enzima. In presenza del morsetto scorrevole, le DNA polimerasi sono molto più processuali, rendendo la replicazione più rapida ed efficiente.

Estendere il primer

La DNA polimerasi è ora pronta per iniziare la sintesi del nuovo filamento di DNA (in E. coli, la polimerasi replicativa primaria è chiamata DNA polimerasi III). Come già sapete, la sintesi di nuovo DNA si ottiene mediante l'aggiunta di nuovi nucleotidi complementari a quelli del filamento parentale. La DNA polimerasi catalizza la reazione mediante la quale un deossiribonucleotide entrante, complementare allo stampo, viene aggiunto all'estremità 3' del nucleotide precedente, a partire dal 3'OH all'estremità del primer dell'RNA. L'importanza del gruppo 3'OH risiede nella natura della reazione che costruisce una catena di nucleotidi.

La reazione catalizzata dalla DNA polimerasi avviene attraverso l'attacco nucleofilo del gruppo 3'OH all'estremità di un filamento di acido nucleico sull'α fosfato del dNTP entrante (Figura 7.21). L'immediata idrolisi del pirofosfato che viene staccato dal dNTP in entrata fa avanzare la reazione. L'aggiunta sequenziale di nuovi nucleotidi all'estremità 3' della catena in crescita del DNA spiega il fatto che il filamento cresce in una direzione da 5' a 3'.

Il 5' fosfato su ciascun nucleotide entrante è unito dalla DNA polimerasi al 3' OH all'estremità della catena di acido nucleico in crescita, per formare un legame fosfodiesterico. Ogni nucleotide aggiunto fornisce un nuovo 3'OH, consentendo alla catena di estendersi finché la DNA polimerasi continua a sintetizzare il nuovo filamento. Come abbiamo già notato, i nuovi filamenti di DNA vengono sintetizzati mediante l'aggiunta di nucleotidi di DNA all'estremità di un primer di RNA. La nuova molecola di DNA ha quindi un breve pezzo di RNA all'inizio.

• Le DNA polimerasi possono solo estendere un filamento nella direzione da 5' a 3'. La crescita da 5' a 3' di entrambi i nuovi filamenti significa che uno dei filamenti è fatto a pezzi.

Filo conduttore

Sappiamo che le DNA polimerasi possono solo costruire un nuovo filamento di DNA nella direzione da 5' a 3'. Sappiamo anche che i due filamenti parentali del DNA sono antiparalleli. Ciò significa che ad ogni fork di replicazione, un nuovo filamento, chiamato filamento principale, può essere sintetizzato continuamente nella direzione da 5' a 3' perché viene prodotto nella stessa direzione in cui si sta aprendo il fork di replicazione.

Filo in ritardo

Anche la sintesi dell'altro nuovo filamento, chiamato filamento in ritardo, procede nella direzione da 5' a 3'. Ma poiché i filamenti modello corrono in direzioni opposte, il filamento in ritardo si estende nella direzione opposta all'apertura della forcella di replicazione (Figura 7.22). Quando il fork di replicazione si apre, sarà necessario copiare la regione dietro il punto iniziale originale per il filamento in ritardo. Ciò significa che un altro primer di RNA deve essere stabilito ed esteso. Questo processo si ripete man mano che la forcella di replicazione si apre, con più primer di RNA depositati ed estesi, producendo molti brevi pezzi che vengono successivamente uniti. Questi brevi pezzi di acido nucleico, ciascuno composto da un piccolo tratto di primer di RNA e circa 1000-2000 nucleotidi di DNA, sono chiamati frammenti di Okazaki, in onore di Reiji Okazaki, lo scienziato che per primo ne dimostrò l'esistenza.

• L'uso di primer di RNA richiede che i nucleotidi di RNA debbano essere rimossi e sostituiti con nucleotidi di DNA.

Rimozione del primer

Abbiamo visto che ogni frammento di DNA appena sintetizzato inizia con un primer di RNA, creando effettivamente un nuovo filamento di acido nucleico che è in parte RNA e in parte DNA. Non si può permettere che il filamento di DNA appena formato abbia pezzi di RNA attaccati. Quindi, i nucleotidi dell'RNA devono essere rimossi e le lacune riempite con nucleotidi del DNA (Figura 7.23). Questo viene fatto dalla DNA polimerasi I in E. coli. Questo enzima inizia ad aggiungere nucleotidi di DNA alla fine di ogni frammento di Okazaki. Tuttavia, l'estremità di un frammento di Okazaki è adiacente al primer di RNA all'inizio del successivo frammento di Okazaki. La DNA polimerasi I ha un'attività esonucleasica che agisce nella direzione da 5' a 3' che rimuove i nucleotidi dell'RNA prima di essa, mentre l'attività della polimerasi sostituisce i nucleotidi dell'RNA con dNTP. Una volta che tutti i nucleotidi dell'RNA sono stati rimossi, il filamento in ritardo è costituito da tratti di DNA. I pezzi di DNA vengono quindi uniti insieme dall'enzima DNA ligasi.

I passaggi descritti sopra essenzialmente completano il processo di replicazione del DNA. Ma rimane ancora un problema.

• Garantire l'accuratezza nella copia di così tante informazioni

Precisione

Quanto è accurata la copia delle informazioni da parte della DNA polimerasi? Come sapete, i cambiamenti nella sequenza del DNA (mutazioni) possono modificare la sequenza aminoacidica delle proteine ​​codificate e questo è spesso, anche se non sempre, deleterio per il funzionamento dell'organismo. Quando miliardi di basi nel DNA vengono copiate durante la replicazione, come fanno le cellule a garantire che il DNA appena sintetizzato sia una copia fedele delle informazioni originali?

Le DNA polimerasi, come abbiamo notato in precedenza, lavorano velocemente (in media 50 basi al secondo nelle cellule umane e fino a 200 volte più veloci in E. coli). Tuttavia, sia le cellule umane che quelle batteriche sembrano replicare il loro DNA in modo abbastanza accurato. Questo perché le DNA polimerasi replicative hanno una funzione di correzione di bozze che consente alla polimerasi di rilevare quando è stata inserita la base sbagliata di fronte a un filamento modello, eseguire il backup e rimuovere la base inserita per errore, prima di continuare con la sintesi (Figura 7.24).

Figura 7.24 - Errore corretto dalle DNA polimerasi

Molteplici attività

Ciò è possibile perché la maggior parte delle DNA polimerasi sono enzimi a doppia funzione. Possono estendere una catena di DNA in virtù della loro attività polimerasica da 5' a 3'. Alcune polimerasi come la DNA polimerasi I possono anche rimuovere i primer dell'RNA nella direzione da 5' a 3', sebbene questa non sia un'attività comune delle polimerasi. Molte polimerasi, tuttavia, hanno la capacità di tornare indietro e rimuovere l'ultima base inserita perché possiedono un'attività esonucleasica da 3' a 5'.

L'attività esonucleasica di una DNA polimerasi le consente di asportare una base inserita in modo errato, dopodiché l'attività della polimerasi inserisce la base corretta e procede con l'estensione del filamento.

In altre parole, la DNA polimerasi monitora la propria accuratezza (chiamata anche fedeltà) mentre crea nuovo DNA, correggendo gli errori immediatamente prima di passare all'aggiunta della base successiva. Questo meccanismo, che opera durante la replicazione del DNA, corregge molti errori man mano che si verificano, riducendo di circa 100 volte gli errori commessi durante la copia del DNA.

DNA polimerasi

Come notato in precedenza, sia le cellule procariotiche che quelle eucariotiche hanno più DNA polimerasi. In E.coli, ad esempio, la DNA polimerasi III è la principale polimerasi replicativa (nota anche come replicasi) mentre la DNA polimerasi I è responsabile della riparazione del DNA, nonché della rimozione dei primer dell'RNA e della loro sostituzione con i nucleotidi del DNA durante la replicazione. La DNA polimerasi II svolge un ruolo nel riavviare la replicazione dopo che il danno al DNA ha bloccato la replicazione, mentre le DNA polimerasi IV e V sono entrambe necessarie nella sintesi della trans-lesione, o bypass, che consente la replicazione oltre i siti di danno al DNA.

Polimerasi eucariotiche

Negli eucarioti ci sono più di quindici diverse DNA polimerasi. Le polimerasi replicative primarie nel nucleo sono ∂ e ε. La DNA polimerasi α è importante anche per la replicazione perché ha attività di primasi e riparazione. La replicazione è avviata nelle cellule eucariotiche dalla DNA polimerasi α, che si lega al complesso di inizio all'origine e stabilisce un primer di RNA, seguito da circa 25 nucleotidi di DNA. Viene quindi sostituito da un'altra polimerasi, in una fase chiamata interruttore pol. La DNA polimerasi ∂ o ε continua quindi a sintetizzare il DNA, a seconda del filamento. Il ruolo della polimerasi ε sembra essere la sintesi del filamento principale a causa della sua elevata processività e accuratezza, mentre la polimerasi ∂ estende i frammenti di Okazaki sui filamenti in ritardo. Sono presenti anche proteine ​​​​analoghe al caricatore a pinza e al morsetto scorrevole. La proteina RFC svolge il ruolo di caricatore del morsetto, mentre un'altra proteina, PCNA, agisce come il morsetto scorrevole. Diverse altre DNA polimerasi come β, γ e μ funzionano nella riparazione delle lacune. Altri ancora sono coinvolti nella sintesi della trans-lesione in seguito al danno al DNA e sono associati all'ipermutazione.

Nonostante la loro diversità, le DNA polimerasi condividono alcune caratteristiche strutturali comuni. Studi cristallografici a raggi X hanno dimostrato che questi enzimi hanno una struttura che è stata paragonata a quella della mano destra umana (Figure 7.25 e 7.26). Il «palmo» della mano forma una fenditura in cui giace il DNA. La fessura è anche il luogo in cui risiede l'attività catalitica della polimerasi. Questo è dove il nucleotide in arrivo viene aggiunto alla catena in crescita. Le «dita» posizionano il DNA nel sito attivo, mentre il «pollice» trattiene il DNA mentre esce dalla polimerasi. Un dominio separato contiene l'attività esonucleasica (correzione di bozze) dell'enzima.

L'enzima alterna tra la sua attività di polimerizzazione e la sua attività di correzione di bozze. Quando una coppia di basi non corrispondenti si trova nel sito catalitico della polimerasi, l'estremità 3' del filamento in crescita viene spostata dal sito della polimerasi al sito attivo dell'esonucleasi (Figura 7.26). Il mispair all'estremità viene rimosso dall'esonucleasi, seguito dal riposizionamento dell'estremità 3' nel sito attivo della polimerasi per continuare la sintesi.

Cessazione della replica

Nei cromosomi batterici circolari esistono sequenze specifiche note come terminatori o siti Ter. Si tratta di brevi sequenze multiple che fungono da siti di terminazione, consentendo alle forcelle di replicazione che viaggiano in senso orario e antiorario attraverso il cromosoma circolare di incontrarsi in uno dei siti.

Il legame di una proteina, Tus, in un sito Ter impedisce l'ulteriore movimento della forcella di replicazione e termina la replicazione. Il DNA circolare parentale e quello appena formato sono, a questo punto, topologicamente interconnessi e devono essere separati con l'aiuto della topoisomerasi.

Il problema della replica finale

Non esiste un sito fisso per la terminazione nei cromosomi eucariotici lineari. Quando le forcelle di replicazione raggiungono le estremità del cromosoma, il filamento principale può essere sintetizzato fino all'estremità del filamento modello. Sul filamento in ritardo, la necessità di un primer di RNA per avviare la sintesi crea una sfida. Quando il primer di RNA all'estremità del filamento in ritardo viene rimosso, c'è un piccolo tratto del filamento modello che non può essere copiato. Di conseguenza, in ogni ciclo di replicazione andrà persa una breve sequenza alle estremità del cromosoma. Nel tempo, con molti cicli di replicazione, i cromosomi diventerebbero notevolmente più corti. Questo accorciamento dei cromosomi è stato osservato in vitro, in colture di cellule somatiche di mammiferi. Si osserva anche negli organismi intatti, con l'aumentare dell'età.

Telomeri

Che effetto ha sulle cellule la perdita di sequenza dalle estremità dei cromosomi? Sappiamo che le estremità dei cromosomi sono caratterizzate da strutture chiamate telomeri (Figura 7.28). I telomeri sono costituiti da molte copie di brevi sequenze ripetute (negli esseri umani, la ripetizione è TTAGGG) e proteine ​​speciali che si legano specificamente a queste sequenze. Questa struttura dei telomeri è utile per distinguere le estremità dei cromosomi dalle rotture del doppio filamento nel DNA, impedendo così ai meccanismi di riparazione del DNA nelle cellule di unire i cromosomi da un'estremità all'altra.

L'altro vantaggio delle sequenze ripetute, che non codificano proteine, è che la perdita di alcune delle ripetizioni non porta alla perdita di importanti informazioni di codifica. Pertanto, le ripetizioni agiscono come una sorta di zona cuscinetto, in cui la perdita di sequenza non condanna la cellula. Tuttavia, l'accorciamento dei cromosomi non può continuare indefinitamente. Dopo un certo numero di cicli di replicazione, è noto che le cellule smettono di dividersi ed entrano in uno stato noto come senescenza replicativa. Ciò suggerisce che l'accorciamento dei telomeri serve come una sorta di orologio, con l'entità del restringimento dei cromosomi che serve come misura dell'invecchiamento. Alla fine le cellule che entrano in senescenza moriranno.

Figura 7.28 - Cromosomi con telomeri marcati in bianco

Problemi con la perdita di sequenza

Anche se le nostre cellule sono in grado di funzionare con cromosomi più corti durante la nostra vita, questo ci lascia con un altro problema. Se i nostri cromosomi si accorciano con l'età, presumibilmente i nostri figli, che ereditano i nostri cromosomi, nasceranno con cromosomi più corti di quelli con cui abbiamo iniziato. A loro volta, i loro cromosomi si restringerebbero man mano che crescevano e i loro figli avrebbero cromosomi ancora più corti. Nel corso di più generazioni, ciò porterebbe al punto in cui un ulteriore restringimento dei cromosomi comporterebbe cellule che entrerebbero in senescenza molto presto nella vita e morirebbero subito dopo. Questo ovviamente non accade. Generazione dopo generazione, i bambini nascono con cromosomi interi, quindi esiste un meccanismo che deve garantire che almeno nelle cellule riproduttive i cromosomi non si accorcino.

Per comprendere questo meccanismo, è necessario prima esaminare l'estremità di una molecola di DNA appena formata (Figura 7.29). Mentre il filamento principale, che cresce nella stessa direzione del movimento della forcella di replicazione, può copiare il suo modello fino alla fine, il filamento in ritardo incontra un problema. I primer di RNA sono, come abbiamo notato, necessari per avviare ciascuno dei frammenti di Okazaki del filamento in ritardo. I primer devono essere rimossi successivamente e i nucleotidi di RNA sostituiti con nucleotidi di DNA. Quando il primer dell'RNA dall'estremità del filamento parentale viene rimosso, i nucleotidi dell'RNA non possono essere sostituiti dai nucleotidi del DNA perché la DNA polimerasi non ha un primer da cui partire. Una breve regione del modello non può quindi essere copiata.

Figura 7.29 - La replicazione di un cromosoma lineare provoca la perdita di sequenze alle estremità ad ogni ciclo di replicazione

Telomerasi

Come si può risolvere questo problema? Si può vedere dalla Figura 7.29 che l'estremità del filamento stampo originale ha una breve sporgenza di 3' risultante dalla rimozione del primer di RNA di fronte ad essa. Per riempire questa regione, sarebbe necessario un altro primer, situato oltre l'estremità del filamento stampo. Ma per costruire un tale primer, sarebbe necessario che la sporgenza del modello fosse più lunga. Se fosse possibile allungare il filo del modello, allora un altro primer potrebbe essere posizionato di fronte alla sua estremità e l'estremità del filo potrebbe essere copiata. Tale estensione del filamento modello è esattamente ciò che accade nelle nostre cellule riproduttive. Il filamento del modello parentale è esteso dall'enzima telomerasi, che aggiunge ripetizioni telomeriche e allunga il modello. Vedremo a breve come realizza questa impresa.

Modello di RNA

La telomerasi è un enzima insolito, in quanto è costituito da due componenti, un RNA e una trascrittasi inversa. Una trascrittasi inversa è una DNA polimerasi RNA-dipendente, un enzima che copia uno stampo di RNA per produrre il DNA. Il componente RNA della telomerasi umana, chiamato hTERC, ha una sequenza complementare alla ripetizione telomerica, TAGGG. Come si vede nella Figura 7.31, questo RNA può appaiarsi con l'ultima ripetizione telomerica sul filamento di DNA parentale, mentre una parte dell'RNA rimane spaiata.

Modello per estensione

La funzione della regione spaiata dell'RNA è quella di fungere da modello che può essere utilizzato per estendere l'estremità 3' sporgente della molecola di DNA originale. La componente proteica della telomerasi ha attività di trascrittasi inversa e può copiare la sequenza dell'RNA nel DNA. Nella telomerasi umana, la componente proteica è nota come hTERT (telomerasi trascrittasi inversa). Come si vede nelle Figure 7.31 e 7.32, la trascrittasi inversa estende lo sbalzo 3' originale utilizzando il componente RNA come stampo. La telomerasi può quindi dissociarsi e ripetere il processo più volte per aggiungere molte ripetizioni della sequenza telomerica.

Una volta che la sporgenza è stata estesa con l'aggiunta di almeno diverse ripetizioni telomeriche, ora c'è spazio per la sintesi di un primer di RNA complementare alla sporgenza appena estesa (che punta indietro verso il resto del cromosoma). Questo primer può quindi essere esteso per completare la sintesi del filamento in ritardo fino alla fine del filamento di DNA parentale originale. Pertanto, l'aggiunta di ripetizioni telomeriche sui filamenti di DNA parentale impedisce ai filamenti di DNA appena formati di accorciarsi ad ogni ciclo di replicazione. Il fatto che ciò avvenga nelle cellule germinali (cellule riproduttive) spiega perché ogni generazione non ha cromosomi più corti della generazione dei genitori.

La funzione di correzione delle bozze delle DNA polimerasi monitora l'accuratezza della replicazione del DNA mentre l'enzima telomerasi impedisce l'accorciamento dei cromosomi che verranno trasmessi alla prole. Insieme, queste due attività assicurano che le informazioni genetiche vengano copiate accuratamente e che le generazioni successive ricevano una serie completa di informazioni genetiche

Disassemblaggio e riassemblaggio dei nucleosomi

Gli eventi di replicazione hanno un'ulteriore svolta negli eucarioti. Ricordiamo che il DNA si trova nelle cellule eucariotiche come cromatina, un complesso del DNA con le proteine. Nella sua forma meno condensata, la cromatina sembra una stringa di perline, costituita dal DNA avvolto attorno ai nuclei degli istoni per formare i nucleosomi. La struttura del nucleosoma deve essere interrotta per rendere il DNA disponibile per la replicazione e ripristinata dopo che la replicazione è stata completata (Figura 7.33).

Prima della forcella di replicazione, la struttura della cromatina viene smontata dai complessi di rimodellamento della cromatina dipendenti dall'ATP, consentendo l'accesso allo stampo del DNA. Una volta che i nuovi filamenti di DNA sono stati sintetizzati, sia i nucleosomi originali che i nuovi nucleosomi devono essere riassemblati dietro la forcella di replicazione. Poiché la replicazione dà origine a due molecole di DNA dove ce n'era una, è necessario il doppio della quantità di istoni per impacchettare il DNA. La preparazione per la replicazione del DNA, quindi, comporta la sintesi di grandi quantità di istoni per soddisfare il fabbisogno. È interessante notare che sembra che il DNA appena sintetizzato sia confezionato in nucleosomi utilizzando gli istoni originali che sono stati spostati per consentire il passaggio della forcella di replicazione, così come gli istoni appena sintetizzati.

Sappiamo anche che modifiche post-traduzionali come l'acetilazione, la metilazione o la fosforilazione degli istoni possono regolare il grado in cui una data regione del genoma è accessibile per l'uso. Una questione che rimane oggetto di intense ricerche è come queste modifiche vengano accuratamente trasmesse ai nuovi nucleosomi.